研究背景
胶原蛋白是普遍存在于动物结缔组织中的一类纤维状蛋白，也是构成细胞外基质（extracellularmatrixc，ECM）的主要成分，占动物总蛋白的25~30%。它具有由三条肽链相互缠绕而成的三螺旋稳定结构，在维持组织结构和功能的完整性方面起着至关重要的作用。目前，研究人员已根据胶原蛋白的序列同源性和分子结构将其分为29种类型（I-XXIX型），其中，I型胶原蛋白在研究中最为常见，它含有3条α-链，组成方式一般为[α1(I)]2α2(I)或[α1(I)]3。因其具有优良的生物相容性、生物降解性以及低抗原性，而在食品、材料以及化妆品等领域有着较为广泛的应用。目前，胶原蛋白的制备来源主要为陆生哺乳动物的皮肤和骨骼，但由于多种人畜共患病的爆发以及宗教信仰等问题，使得该种胶原蛋白在实际生产应用中受到了极大的限制。因此，许多研究人员开始将注意力集中在水生胶原蛋白上，例如鲷鱼、海参、金枪鱼等，都已被认为是天然胶原蛋白的提取来源。
海蜇是海蜇属的统称，目前普遍分布于热带、亚热带以及温带沿海地区。随着人工繁育的成功，海蜇数量不断增加，但由于其收获期短、易受腐败影响，大多因并未得到及时处理，而造成了严重的经济和社会影响。海蜇中蛋白质含量约占干物质的60%，其中胶原蛋白为主要蛋白，占总蛋白的50%左右。因此，海蜇可作为一种天然安全的胶原蛋白提取来源，极具开发价值。目前，国内外对海蜇胶原蛋白的提取研究较多，但对其结构特性的相关研究比较少。基于此，李春阳团队采用胃蛋白酶从海蜇中提取胶原蛋白，并通过紫外光谱、傅里叶变换红外光谱、圆二色谱等分析手段对海蜇胶原蛋白结构特性进行系统研究，旨在提高海蜇的产品附加值，减少资源浪费，并为利用海蜇胶原蛋白进一步制备出生物材料和活性肽提供有利的参考。
1基本成分分析
由表1可知，海蜇中大部分都是水分，仅含有不到10%的干物质。在海蜇干物质中，蛋白质所占比重最大，可达73.03%。羟脯氨酸是胶原蛋白特有的一种氨基酸，常被用于计算胶原蛋白的含量。因而根据海蜇中羟脯氨酸的含量，计算得出胶原蛋白的含量为1.96%，占蛋白质总量39.12%。可见海蜇中胶原蛋白含量较为丰富，是一种优质的水生胶原蛋白来源。
2氨基酸组成分析
由表2可知，海蜇胶原蛋白中含有7种必需氨基酸（Val、Ile、Leu、Phe、Met、Thr、Lys），占总氨基酸的20.19%。主要氨基酸为Gly，占氨基酸总量的25.99%。Gly对于胶原蛋白超螺旋结构的形成至关重要，它具有由单个氢原子构成的极小侧链，可存在于超螺旋的中心且不会发生链变形，从而使三个α螺旋紧密堆积在一起，形成具有疏水性的超螺旋结构。据相关文献报道，由于亚氨酸（Pro+Hyp）的吡咯环会限制肽链二级结构变化，同时Hyp还通过羟基形成链间氢键，维持胶原的三螺旋稳定结构，因此胶原蛋白的亚氨酸含量对其稳定性有很大的影响。海蜇胶原蛋白中亚氨酸含量为15.94%，略低于花鳗鲡鱼（18.9％）和鳗鱼（20％），与鲤鱼（15.4％）胶原蛋白含量相似。此外，海蜇胶原蛋白中还含有丰富的Glu、Asp、Ala和Arg。其中，Glu和Asp是酸性氨基酸，二者对胶原蛋白的等电点影响较大。His和Met含量较低，未检测到半胱氨酸和色氨酸。
3SDS-PAGE分析
海蜇胶原蛋白的SDS-PAGE图谱如图1所示。海蜇胶原蛋白中主要含有一条kDa左右的α-链，以及由α-链的分子内和分子间交联所形成的一些二聚体β-链和三聚体γ-链。通过比较海蜇胶原蛋白在还原和非还原条件下的图谱，发现二者条带完全一致，说明海蜇胶原蛋白中不存在二硫键，即不存在含硫氨基酸，这是Ⅰ型胶原蛋白的一个特点。另外，在48~kDa之间还观察到少量条带，这些小分子片段可能是由于胃蛋白酶对胶原蛋白的肽酶区域进行部分切割而得到的降解片段。由图可初步判断所提胶原蛋白为I型胶原蛋白，亚基结构为[a1(I)]3，符合大多数水生胶原蛋白的结构特征。
4紫外全波长扫描分析
海蜇胶原蛋白在~nm处的UV谱图如图2所示。其最大吸收峰位于nm处，这主要与肽链中含有的-C=O，-COOH和CO-NH2等生色基团在nm附近具有明显的吸收峰有关。此外，在nm处还可观察到一较弱的吸收峰，结合氨基酸分析，这可能是由于分子内部仍含有少量的酪氨酸，存在共轭双键引起的。以上结果符合I型胶原蛋白的紫外吸收特征，与Zhang，蔡路昀等报道的水生胶原蛋白的特性基本相似。
5傅里叶变换红外光谱分析
海蜇胶原蛋白在~0cm-1处的FTIR谱图如图3所示。在酰胺Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ以及A、B带均可观察到明显的特征峰，说明海蜇胶原蛋白具有典型的胶原蛋白红外光谱特征吸收峰。其中，酰胺A带位于.06cm-1处，该峰与胶原蛋白中N-H的伸缩振动以及羰基形成的氢键相关。通常，N-H伸缩振动范围为3~cm-1，但当其与肽链中含有的羰基形成的氢键结合时，其波数会蓝移至cm-1左右。由此可说明海蜇胶原蛋白中存在氢键。此外，在.18cm-1处还观察到由CH2的不对称伸缩振动引起的酰胺B带。
酰胺Ⅰ、Ⅱ和Ⅲ带的伸缩振动与胶原蛋白的氨基酸序列及三螺旋结构直接相关。海蜇胶原蛋白的酰胺Ⅰ带位于.5cm-1处，且吸收最强，该峰与肽链的C=O伸缩振动有关，说明海蜇胶原蛋白处于交联状态。由N-H弯曲振动与C-N伸缩振动相耦合引起的酰胺Ⅱ带通常出现在~cm-1之间，当肽链中有氢键存在时波数蓝移。海蜇胶原蛋白的酰胺Ⅱ带位于.08cm-1处，进一步证明了其肽链中存在氢键。特征频率在1~cm-1之间，称为酰胺Ⅲ带，主要与酰胺键的C-N伸缩振动和N-H弯曲振动，以及Gly主链和Pro侧链的CH2的摇摆振动有关。有研究称，当酰胺Ⅲ带的峰值与1~cm-1范围内的峰值比例为1.0时，胶原蛋白的三螺旋结构是完整的。由图知海蜇胶原蛋白酰胺Ⅲ带的波数为.08cm-1，其与cm-1谱带之间的峰值比约为1.0，说明所提胶原蛋白具有较完整的三螺旋结构。
6圆二色谱分析
圆二色谱是一种利用生物大分子对左旋和右旋圆偏振光的吸收差异来进行立体结构分析的方法，根据电子跃迁能级能量的大小，蛋白质的CD谱可分为远紫外（~nm）、近紫外（~nm）和紫外-可见（~nm）三个区域，远紫外区是肽键所在的吸收范围，对胶原蛋白在此范围内的谱带位置和吸收强弱进行分析，可较直观的反映肽链的立体结构信息。因此，利用远紫外圆二色谱对海蜇胶原蛋白的二级结构进行深入分析，如图4示，海蜇胶原蛋白在nm附近出现明显的负吸收峰，在nm处有一较弱的正吸收峰，在nm处有一交叉点，这是左旋聚脯氨酸构型的典型CD特征，主要表现为β-折叠和无规则卷曲的叠加吸收。此外，圆二色谱的正负峰强度比称为RPN，RPN值是胶原三螺旋结构的特征性指标，非变性胶原的RPN值一般在0.12左右，观察到海蜇胶原蛋白的RPN值为0.11。以上光谱数据进一步说明了海蜇胶原蛋白保持了较完整的三螺旋结构，与红外吸收光谱分析结论一致。
7微观结构分析
胶原蛋白的微观结构对其生物学功能有着关键性的影响。由图5可知，冻干的海蜇胶原蛋白在肉眼下呈白色海绵状固体，表面有均匀孔隙，触之弹性较好。由SEM图像，观察到海蜇胶原蛋白具有多层聚集、以纤维为主的无规则网状结构。在更高的放大倍数下，发现该结构由相互缠绕的细丝和薄片构成，且表面光滑细腻、疏松多孔，与Arumugam等观察到的龙利鱼胶原蛋白的微观结构相似，说明海蜇胶原蛋白保留了较完整的纤维结构，排布比较疏松，可作为伤口敷料、止血剂或细胞增殖的基质等广泛应用于生物医学工程。
8结论
采用盐酸-胃蛋白酶法对海蜇胶原蛋白进行制备并分析了其结构特性。氨基酸组成分析表明海蜇胶原蛋白中甘氨酸含量最高，为25.99%，亚氨基酸含量为15.94%，未检测到半胱氨酸和色氨基酸；紫外光谱和SDS-PAGE表明所提取的海蜇胶原蛋白纯度较高，亚基结构为[a1(I)]3，符合I型胶原蛋白结构特征；傅里叶变换红外光谱和圆二色谱说明海蜇胶原蛋白具有较为完整的三螺旋结构；扫描电镜结果显示其保留了较完整的纤维结构，且疏松多孔，可作为良好的药物载体。海蜇胶原蛋白具备替代陆生哺乳动物胶原蛋白的潜力，在食品、化妆品、生物医药及组织工程等领域有广阔的应用前景。
作者简介
李春阳研究员
李春阳，研究员/博导，博士毕业于江南大学食品学院。在加拿大阿尔伯塔大学和曼尼托巴大学分别留学一年，柬埔寨国家高级农业顾问，江苏省农业科学院营养与功能食品研究室主任、粮经作物加工首席专家，研究领域为：农产品营养与活性功能、食品生物化学、农产品精深加工技术。发表研究论文多篇，SCI论文50篇，主持主研国家及省部级以上课题40多项，获授权发明专利18项，获省部级以上科学技术奖2项、市厅级科学技术奖8项。
编辑：汤梦怡主编：冯媛媛版权声明
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